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液氮罐細(xì)胞冷凍原理

點擊次數(shù):981 更新時間:2020-06-12

實驗原理查特杜瓦瓶

細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存的主要方法之一。利用凍存技術(shù)將細(xì)胞置于-196~C液氮中低溫保存,可以使細(xì)胞暫時脫離生長狀態(tài)而將其細(xì)胞特性保存起來,這樣在需要的時候再復(fù)蘇細(xì)胞用于實驗。而且適度地保存一定量的細(xì)胞,可以防止因正在培養(yǎng)的細(xì)胞被污染或其他意外事件而使細(xì)胞丟種,起到了細(xì)胞保種的作用。除此之外,還可以利用細(xì)胞凍存的形式來購買、寄贈、交換和運送某些細(xì)胞。 細(xì)胞凍存時向培養(yǎng)基中加入保護(hù)劑——終濃度5%~15%的甘油或二甲基亞砜(DMSO),可使溶液冰點降低,加之在緩慢凍結(jié)條件下,細(xì)胞內(nèi)水分透出,減少了冰晶形成,從而避免細(xì)胞損傷。標(biāo)準(zhǔn)冷凍速度開始為-1 到 -2℃/min,當(dāng)溫度低于-25℃時可加速,到-80℃之后可直接投入液氮內(nèi)(-196℃)。

目前常用的保護(hù)劑為二甲亞砜(DMSO)和甘油,它們對細(xì)胞無毒性,分子量小,溶解度大,易穿透細(xì)胞。

實驗材料

儀器:液氮罐、凍存管(塑料螺口凍存管或安瓿瓶)、離心管、吸管、離心機(jī)等

試劑:0.25%胰酶、培養(yǎng)基、含保護(hù)劑的培養(yǎng)基(即凍存液)

附:凍存液配制:培養(yǎng)基加入甘油或DSMO,使其終濃度達(dá)5-20%。保護(hù)劑的種類和用量視不同細(xì)胞而不同。配好后4℃下保存。

實驗步驟

1.消化細(xì)胞,將細(xì)胞懸液收集至離心管中。

2.1000rpm離心10分鐘,棄上清液。

3.沉淀加含保護(hù)液的培養(yǎng),計數(shù),調(diào)整至5×106/ml左右。

4.將懸液分至凍存管中,每管1ml。查特杜瓦瓶

5.將凍存管口封嚴(yán)。如用安瓿瓶則火焰封口,封口一定要嚴(yán),否則復(fù)蘇時易出現(xiàn)爆裂。

6.貼上標(biāo)簽,寫明細(xì)胞種類,凍存日期。凍存管外拴一金屬重物和一細(xì)繩。

7.按下列順序降溫:室溫→4℃(20分鐘)→冰箱冷凍室(30分鐘)→低溫冰箱(-30℃ 1小時)→氣態(tài)氮(30分鐘)→液氮。

注意:操作時應(yīng)小心,以免液氮凍傷。液氮定期檢查,隨時補充,不能揮發(fā)干凈,一般30立升的液氮能用1~1.5月。查特杜瓦瓶

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